Оксидативный стресс сперматозоидов (АФК\ROS тест)
ПРИЧИНЫ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА СПЕРМАТОЗОИДОВ (АФК\ROS тест)
Активные формы кислорода (АФК), или reactive oxygen species (ROS), являются метаболитами кислорода и включают супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильные и гидропероксильные радикалы и оксид азота.
Когда АФК присутствуют в сперме в избытке, они могут инициировать патологические изменения сперматозоидов, вызывая окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК. Такие нарушения получили названия оксидативный стресс (ОС) сперматозоидов.
За счет снижения подвижности, нарушения акросомной реакции, повреждения рецепторов сперматозоидов ОС приводит к снижению вероятности наступления беременности. Вызывая разрывы (фрагментацию) ДНК сперматозоидов ОС приводит к нарушению развития зародыша, что сопровождается замершими беременностями, выкидышами на ранних сроках, аномалиями развития и возникновением злокачественных новообразований у детей.
Ч еловеческий сперматозоид очень восприимчив к оксидативному стрессу.
ОС сперматозоидов оказывает отрицательное влияние, как на прогноз естественного зачатия, так и на результаты вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в т.ч. ИКСИ.
Согласно Рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO-2010), Европейской ассоциации репродукции человека и эмбриологии (ESHRE-2016) и Европейской урологической ассоциации (EAU-2017) определение АФК входит в перечень рекомендуемых методов обследования при мужском бесплодии и нарушениях развития беременности.
Источник
Борьба с оксидативным стрессом эякулята у пациентов, готовящихся к программам ВРТ (ЭКО/ИКСИ)
По различным статистическим данным, от 15% до 25% пар при попытке забеременеть вынуждены обращаться за медицинской помощью с целью повышения своих шансов на успешную беременность [1, 2]. Внедрение в клиническую практику программ ВРТ позволило реализовать функцию деторождения при различных заболеваниях как у женщин, так и у мужчин, которые ранее считались абсолютно бесперспективными [2,3]. При этом причину, вызывающую снижение фертильности, не всегда можно обнаружить [4].
В настоящее время считается, что окислительный стресс (ОС) является частой причиной мужского бесплодия [5]. По оценкам 25–30% бесплодных мужчин обладают высоким уровнем активных форм кислорода (ROS) спермы, тогда как фертильные мужчины не демонстрируют повышения ROS. С одной стороны, контролируемое производство ROS требуется для физиологических процессов сперматозоидов, таких как гиперактивация, конденсация и акросомная реакция, но с другой – чрезмерное производство ROS незрелыми зародышевыми клетками и лейкоцитами вызывает дисфункцию сперматозоидов, а именно: перекисное окисление липидов, потерю моторики и повреждение ДНК спермы [6]. Другими словами, ОС – это дисбаланс между системным проявлением активных форм кислорода и способностью биологической системы легко обезвреживать реактивные промежуточные соединения или восстанавливать возникающий апоптоз
[4, 5].
В здоровом организме прооксиданты и антиоксиданты остаются в равновесии и сперматозоиды, имеющие антиоксидантные защитные механизмы, «инактивируют» ROS, тем самым защищая гонадные клетки и зрелые сперматозоиды от окислительного повреждения [7]. Однако в патологических условиях неконтролируемое производство ROS превышает антиоксидантную способность семенной плазмы, что приводит к ОС [1, 7]. К сожалению, сперматозоиды сами не могут восстановить повреждение, вызванное ОС, поскольку у них отсутствуют необходимые системы восстановления цитоплазматического фермента. Это одна из особенностей, которые делают сперматозоиды уникальными в своей восприимчивости к окислительному стрессу [8]. В основном это связано с тем, что их клеточные мембраны богаты полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), что делает их очень восприимчивыми к кислородному повреждению и, следовательно, перекисному окислению липидов (ПОЛ). Впоследствии быстрая потеря внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) из ПОЛ вызывает повреждение, снижение жизнеспособности сперматозоидов и увеличение морфологических дефектов сперматозоидов [9,10].
ОС стала предметом большой озабоченности для клиницистов и ученых в связи с тем, что этот путь запрограммированного ухудшения также приводит к плохому оплодотворению, некачественному эмбриональному развитию, потере беременности и врожденным дефектам. [11, 12, 13, 14]. И в этом случае применение ВРТ не является преимуществом перед естественной беременностью. Часто сам процесс центрифугирования сперматозоидов в программах ВРТ увеличивает продукцию ROS и вызывает ОС мужских гамет. В исследовании, проведенном Agarwal и др. [15], сообщалось, что производство ROS сперматозоидами человека значительно увеличилось, когда сперматозоиды подвергались повторным циклам центрифугирования. Исследователи отметили, что длительность центрифугирования была более важной, чем сила центрифугирования, что приводило к большей фрагментации ДНК с неблагоприятными последствиями для ВРТ. Повреждение ДНК является поводом для беспокойства, поскольку в программах ВРТ, а именно во время интрацитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ), сперматозоиды со значительным количеством повреждения ДНК имеют возможность оплодотворить ооцит с последующими негативными исходами. [16].
У здоровых мужчин ДНК спермы защищена от ОС двумя основными механизмами. Во-первых, ДНК плотно свернута и упакована в хроматин, так что воздействие ROS на генетический материал минимально[17]. Во-вторых, естественные антиоксиданты в семенной плазме и сперматозоидах помогают минимизировать продукцию ROS до нормального уровня. Некоторые природные антиоксиданты являются ферментами, такими как каталаза и супероксиддисмутаза (СОД), а также неферментативными соединениями, такими как витамины C и E и карнитины. Эти антиоксиданты реагируют и нейтрализуют ROS, способствуя предотвращению возникновения ОС и сохранению функции сперматозоидов [18]. Сперматозоиды также содержат антиоксиданты лактоферрин и коэнзим Q10 [6]. Для сохранения здоровья мужчина должен потреблять достаточное количество антиоксидантов, чтобы предотвратить появление ОС [6]. Однако у некоторых пациентов, страдающих бесплодием, может быть либо перепроизводство ROS, либо недопроизводство антиоксидантов, что нарушает сложный баланс и приводит к ОС. Так что еще одной мерой предосторожности, которую можно принять, является добавление антиоксидантов. Антиоксиданты работают, останавливая окислительную цепную реакцию, устраняя, поглощая или уменьшая образование ROS [9]. Проводились различные исследования для выяснения эффективности каждого отдельного антиоксиданта. Однако результаты были неубедительными, поскольку большинство экспериментов имели небольшой размер выборки, отличались дозировкой и продолжительностью терапии и отсутствием группы контроля [19].
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния препаратов Сперотон и Синергин на изменение показателей оксидативного стресса и индекс фертильности пациентов, планирующих протоколы ВРТ.
Дизайн и методы исследования
В исследование были включены 60 инфертильных мужчин с различными идиопатическими нарушениями спермограммы, в возрасте от 26 до 45 лет. Пациенты с супругами планировали вступление в программы ВРТ. Средний возраст составил 34±3,2 года.
Все пациенты случайным образом были разделены на 3 группы: 1-я группа – 20 пациентов получали исследуемый препарат Сперотон по 1 саше 1 раз в день в течение 3 месяцев; 2-я группа – 20 пациентов получали исследуемый препарат Синергин по 2 капсулы 1 раз в день в течение 3 месяцев, 3-я контрольная группа – 20 пациентов не получали никаких препаратов.
Исследование показателей спермограммы осуществлялось в соответствии с требованиями ВОЗ: до лечения и через 3 месяца от начала приема препарата. Оценивались концентрация, подвижность, морфология сперматозоидов по строгим критериям Крюгера, объем эякулята. Оксидативный стресс в исследовании оценивали по уровню АФК методом OxiSperm – это метод оценки повышенного количества супероксидных радикалов, присутствующих в эякуляте. Тест основан на химических свойствах нитросинего тетразолия (NBT), который находится в наборе OxiSperm в виде реакционного геля (РГ). Оценка результатов производится в процентах (%). Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов производилась методом TUNEL с помощью набора реактивов фирмы MILLOPORE (США). Подсчитывали процент (среднее значение) фрагментированных ядер в препарате данного пациента.
Источник
Оценка оксидативного стресса ros
Комплекс исследований, позволяющий оценить активность свободнорадикальных процессов в организме и состояние систем антиоксидантной защиты.
Оценка окислительного стресса, оценка антиоксидантной защиты.
Синонимы английские
Assessment of oxidative stress, evaluation of antioxidant protection.
Высокоэффективная жидкостная хроматография.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Окислительный (оксидативный) стресс — состояние, при котором в организме слишком много свободных радикалов — молекул без одного электрона.
В нормальных условиях внутриклеточное содержание активных форм кислорода (ROS) поддерживается на низком уровне различными ферментными системами, участвующими в редокс-гомеостазе. Поэтому окислительный стресс можно рассматривать как дисбаланс между прооксидантами и антиоксидантами в организме. В течение последних двух десятилетий окислительный стресс был одной из самых острых проблем среди биологических исследователей во всем мире. Стресс можно определить как процесс измененного биохимического гомеостаза, вызванного психологическими, физиологическими или экологическими причинами (стрессорами). Любое изменение в гомеостазе приводит к увеличению производства свободных радикалов, значительно выше детоксикационной способности местных тканей. Эти избыточные свободные радикалы затем взаимодействуют с другими молекулами внутри клеток и вызывают окислительное повреждение белков, мембран и генов. В процессе этого часто образуется еще больше свободных радикалов, вызывая цепь разрушений. Окислительные повреждения связаны с причиной многих заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, дегенерация нейронов и онкология, а также влияют на процесс старения.
Стресс может запускаться различными стрессорами, например экстремальными условиями окружающей среды, чрезмерными физическими упражнениями или полной иммобилизацией, недоеданием. Внешние факторы, такие как загрязнение, избыточная инсоляция и курение, также вызывают образование свободных радикалов. Стресс может быть острым или хроническим. Стрессор инициирует любой из факторов, играющих решающую роль в поддержании клеточного гомеостаза. Окислительный стресс возникает, когда гомеостатические процессы терпят неудачу, а генерация свободных радикалов намного превышает способность антиоксидантной защиты организма, тем самым способствуя повреждению клеток и тканей.
Окислительный стресс является сложным процессом. Его воздействие на организм зависит от типа окислителя, от места и интенсивности его производства, от состава и активности различных антиоксидантов, а также от способности восстановительных систем.
Термин «ROS» включает в себя все нестабильные (свободные) метаболиты молекулярного кислорода (O2), которые имеют более высокую реакционную способность, чем O2 (например, супероксидный радикал, гидроксильный радикал) и нерадикальные молекулы (например, перекись водорода (H2O2). Эти ROS генерируются как побочный продукт нормального аэробного метаболизма, но их уровень увеличивается при стрессе, что является основной опасностью для здоровья.
До 1-3% легочного поступления кислорода преобразуется в ROS. В условиях нормального метаболизма непрерывное образование свободных радикалов важно для нормальных физиологических функций, таких как генерация АТФ, различные катаболические, анаболические процессы и сопровождающие клеточные окислительно-восстановительные циклы.
Центральная нервная система чрезвычайно чувствительна к повреждению свободных радикалов из-за относительно небольшой общей антиоксидантной способности. ROS, продуцируемые в тканях, могут нанести прямой ущерб макромолекулам, таким как липиды, нуклеиновые кислоты и белки. Полиненасыщенные жирные кислоты являются одной из предпочтительных целей окисления для них. Кислородсодержащие радикалы, в частности радикал супероксидного аниона, гидроксильный радикал (ОН) и алкилпероксильный радикал (OOCR), являются мощными инициаторами перекисного окисления липидов, роль которых хорошо установлена в патогенезе широкого спектра заболевания (например, развитии атеросклероза, прогрессировании фиброза печени).
В результате перекисного окисления липидов в биологических системах накапливаются их конечные продукты, такие как малондиальдегид (MDA), 4-гидрокси-2-ноненол (4-HNE) и F2-изопростанты.
Основания ДНК также очень восприимчивы к окислению ROS, а преобладающим конечным продуктом этого взаимодействия является 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин. В результате могут возникнуть мутации и делеции как в ядерной, так и в митохондриальной ДНК. Митохондриальная ДНК особенно подвержена окислительному повреждению из-за ее близости к первому источнику ROS и недостаточной восстановительной способности по сравнению с ядерной ДНК. Эти окислительные модификации приводят к функциональным изменениям в ферментативных и структурных белках, которые могут оказывать существенное физиологическое воздействие. Также хорошо установлена связь между окислительным стрессом и иммунной функцией организма. Механизм иммунной защиты использует повреждающие эффекты окислителей с защитной целью, используя ROS в уничтожении патогенов. В нескольких исследованиях была продемонстрирована взаимозависимость окислительного стресса, иммунной системы и воспаления. Все факторы, ответственные за окислительный стресс, прямо или косвенно участвуют в механизме защиты иммунной системы. Любые изменения, приводящие к иммуносупрессии, могут спровоцировать развитие болезни. Окислительная модификация белков не только изменяет их антигенный профиль, но также усиливает антигенность. Существует несколько примеров аутоиммунных заболеваний, возникающих в результате таких окислительных модификаций, а именно системная красная волчанка, сахарный диабет и диффузная склеродермия. Более того, окислительный стресс представляет дополнительную угрозу для тканей-мишеней, как в случае бета-клеток, продуцирующих инсулин. Окислительный стресс, вызванный неразрешенным и стойким воспалением, может быть основным фактором, влияющим на изменение динамики иммунных реакций. Эти изменения могут создать иммунологический хаос, который может привести к потере архитектурной целостности клеток и тканей, что в конечном итоге приведет к хроническим заболеваниям или онкологии.
Окислительный стресс может запускать развитие аллергии, аутоиммунных или нейродегенеративных заболеваний (например, болезнь Альцгеймера) наряду с измененным ростом клеток, хроническими инфекциями, ангиогенезом и раковыми заболеваниями. Старение является неотъемлемым процессом, характерным для всех живых клеток. Теория окислительного стресса в настоящее время является наиболее приемлемым объяснением старения, которое подтверждает, что увеличение ROS приводит к функциональным изменениям, патологическим состояниям и другим клинически наблюдаемым признакам старения. В нормальных условиях физиологичным является равновесие между уровнем антиоксидантов и клеточными прооксидантами. Окислительный стресс может быть запущен не только стрессорами, но и дефицитом антиоксидантов, приводящим к образованию избыточного количества активного кислорода или азота. Антиоксиданты являются первой линией на пути предотвращения развития стресса. Несколько первичных антиоксидантных ферментов (SOD, каталаза) и несколько пероксидаз катализируют сложный каскад реакций для превращения ROS в более стабильные молекулы, такие как вода и O2. Помимо первичных антиоксидантных ферментов, большое количество вторичных ферментов действуют в тесной связи с малыми молекулярными антиоксидантами с образованием окислительно-восстановительных циклов, которые обеспечивают необходимые кофакторы для первичных антиоксидантных ферментных функций.
Малые молекулярные неферментные антиоксиданты (например, GSH, NADPH, тиоредоксин, витамины E и C и следовые металлы, такие как селен) также действуют как прямые поглотители ROS. Эти ферментативные и неферментные антиоксидантные системы необходимы для поддержания жизни путем поддержания деликатного внутриклеточного редокс-баланса и минимизации нежелательного повреждения клеток, вызванного ROS.
Эндогенные и экзогенные антиоксиданты включают в себя некоторые высокомолекулярные соединения (SOD, GPx, Catalse, альбумин, металлотионеин) и некоторые низкомолекулярные вещества (мочевая кислота, аскорбиновая кислота, липоевая кислота, глутатион, убихинол, токоферол / витамин E, флавоноиды).
Комплексная оценка оксидативного стресса состоит из количественного определения содержания в крови следующих параметров: коэнзим Q10, витамин Е, витамин С, бета-каротин, глутатион, малоновый диальдегид, 8-ОН-дезоксигуанозин. Диагностика метаболических особенностей организма позволит врачу-специалисту скорректировать антиоксидативный статус пациента до появления симптомов заболевания, используя показатели общего антиоксидантного статуса и перекисного окисления липидов для назначения антиоксидативной терапии.
Для чего используется исследование?
- Для комплексной диагностики оксидативного стресса и степени интоксикации организма;
- для выявления дефицита антиоксидантов и оценки риска заболеваний, ассоциированных с их недостатком (заболевания сердечно-сосудистой системы, иммунодефициты, доброкачественные и злокачественные опухоли, гормональные нарушения, бесплодие, аутоиммунные заболевания);
- для выявления дефицита микроэлементов и витаминов, связанных с антиоксидантными системами организма;
- для выявления генетических форм дефицита ферментов.
Когда назначается исследование?
- При предраковых заболеваниях;
- при аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, диффузная склеродермия);
- при нейродегенеративных заболеваниях;
- при бесплодии и привычном невынашивании беременности;
- при хронических инфекциях;
- при заболеваниях печени;
- при онкологических заболеваниях;
- при подозрении на врождённый дефицит ферментов;
- при заболеваниях сердечно-сосудистой системы.
Что означают результаты?
Отдельно для каждого показателя, входящего в состав комплекса:
Источник