Метициллин резистентный стафилококк чувствителен

А.Н. Маянский
Заведующий кафедрой микробиологии Нижегородской медицинской академии
В.В. Тец
Заведующий кафедрой микробиологии Санкт-Петербургской медицинской академии им. ак. И.П. Павлова

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

С момента появления в 70-х годах и до настоящего времени метициллинрезистентные стафилококки и, прежде всего, метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций. Частота MRSA в структуре стафилококковых инфекций за последние годы резко возросла во всём мире (например в США — с 2% в 1975 г. до 35% в 1996 г.).

Резистентность стафилококков к оксациллину (метициллину) может быть обусловлена тремя основными механизмами:

продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) — ПСБ-2а (фермента, участвующего в синтезе клеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном «mecА» — классическая или истинная резистентность к метициллину (оксациллину);
инактивацию вследствие гиперпродукции бета-лактамаз;
модификацию нормальных ПСБ.

С клинической точки зрения важно дифференцировать штаммы с классической («mecА«-обусловленной) резистентностью, от штаммов с двумя другими редко встречающимися механизмами резистентности, обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью терапия бета-лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) будет неэффективна, кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Фенотипические характеристики, которые могут помочь дифференцировать три перечисленные выше механизма резистентности, изложены в таблице:

Таблица. Типы резистентности к метициллину (оксациллину) у стафилококков.

Тип резистентности	Наличие гена «mec А»	Механизм	Пограничная резистентность	Эффективность ингибиторов бета-лактамаз	Перекрестная резистентность ко всем бета-лактамам	Множественная резистентность к другим классам антибиотиков
Классическая — гомогенная — гетерогенная	+ +	Дополнительный ПСБ (ПСБ-2а)	+/		+ +	+ +
Инактивация бета-лактамазами		Гиперпродукция бета-лактамаз	+	+
Модифицированные ПСБ (1,2,4)		Мутации обычных ПСБ (1,2,4)	+

Штаммы с классическим типом резистентности могут в свою очередь быть гомо- или гетерогенными по типу экспрессии резистентности. При гомогенном типе экспрессии практически все микробные клетки проявляют резистентность в стандартных in vitro тестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клеток проявляет резистентность фенотипически. Нередко только 1 из 10-100 млн. клеток в популяции с наличием гена mecА экспрессирует резистентность, что ведёт к получению пограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину (МПК — 2-8 мг/л). Резистентность, обусловленная гиперпродукцией бета-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, также приводит к получению пограничных значений МПК. Однако, резистентность к оксациллину, обусловленную гиперпродукцией бета-лактамаз, можно легко отличить от классической резистентности по обратимости резистентности при использовании ингибиторов бета-лактамаз.

В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуценты бета-лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.

Наличие классической резистентности наиболее легко определить методом скрининга так как рост микробных клеток с неклассическими типами резистентности обычно ингибируется.

Примечание Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности при хранении по сравнению с метициллином.

Принцип

Для идентификации резистентности к оксациллину (метициллину) у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий:

Наличие в агаре NaCl в концентрации 4%
Сниженная температура инкубации — при 35 o С
Строгое соблюдение длительности инкубации: 24 часа для S.aureus и 48 часов для коагулаза(-) стафилококков
Стандартизированное число микроорганизмов — 1,5 х 10 8
рН 7,2-7,4, так как при более низком рН увеличивается число ложноотрицательных результатов

Микроорганизм

Чистая культура Staphylococcus spp., инкубированная в течение 18-24 часов на кровяном агаре.

Материалы

Агар Мюллер-Хинтон с добавлением 4% NaCl (4 г на 100 мл среды) и 6 мг/л оксациллина (0,6 мг на 100 мл среды). Агар Мюллер-Хинтон хранится при 2-8 o С, готовится согласно прописи на этикетке, 4% NaCl добавляется до автоклавирования.
Субстанция оксациллина с известной активностью предварительно растворяется в стерильной дистиллированной воде (расчет концентрации оксациллина проводят с учетом его активности) и добавляется в охлажденный на водяной бане до 48-50 o С агар Мюллер-Хинтон. Приготовленный агар разливается по чашкам с толщиной слоя агара 3-4 мм (на чашку диаметром 100 мм — 25 мл). Готовые чашки со средой хранятся в пластиковых пакетах при температуре 4-8 o С не более 5 суток.
Для контроля роста необходимо также приготовить чашки с агаром без антибиотика.
Кровяной агар с чистой культурой стафилококка, инкубированной в течение 18-24 ч.
Стерильный физиологический раствор.
Стандарт мутности 0,5 по МакФарланду.
Стерильные тампоны или микропипетка (10 мкл).
Термостат с температурой 35 o С.

Контроль качества

Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллер-Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
Контрольные штаммы (могут быть предоставлены Институтом антимикробной химиотерапии):
S.aureus ATCC 38591 — резистентный.
S.aureus ATCC 29213 — чувствительный.

Постановка теста

Приготовление инокулюма

Инокуляция

Метод I (микропипеткой)
а) приготовить разведение 1:100 стандартного инокулюма 0,5 по МакФарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5×10 6 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физ. раствора).
б) с помощью микропипетки нанесите каплю (10 мкл) разведённой стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.
Метод II (с помощью тампона)
а) погрузите стерильный ватный тампон в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по МакФарланду), затем отожмите избыток влаги о стенку пробирки
б) коснитесь тампоном поверхности агара с оксациллином.

Инкубация

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре +35 o С в течение полных 24 часов, а коагулаза(-) стафилококков — в течение 48 часов.

Примечание. Среда АГВ не может быть рекомендована для постановки теста в связи с высокой частотой ложноположительных результатов.

Учет результата

Интерпретация

Появление видимого роста более 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину).
При отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамма учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
При получении сомнительных результатов, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

Представление результата

S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis), чувствительный к метициллину (оксациллину).
S.aureus или коагулаза(-) стафилококк (S.epidermidis) резистентный к метициллину (MRSA или MRSE).

Метициллин (оксациллин) — резистентные стафилококки должны расцениваться как резистентные ко всем бета-лактамам (пенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам, комбинациям пенициллинов с ингибиторами бета-лактамаз). Кроме того, среди метициллинрезистентных стафилококков очень часто наблюдается ассоциированная резистентность к другим антибиотикам (аминогликозидам, макролидам, хинолонам, тетрациклинам).

Ограничения метода

Скрининг на агаре с оксациллином предназначен для фенотипического определения штаммов имеющих ген mecA, однако, штаммы с другими типами резистентности иногда могут давать ложноположительный результат.
Применение метода скрининга для выявления резистентности к оксациллину (метициллину) менее надёжен у коагулаза(-) стафилококков, чем у S.aureus.

Примечание

Оксациллин, в сравнении с метициллином, менее стабилен к действию стафилококковых бета-лактамаз, что может привести к получению большего числа ложноположительных результатов, чем при использовании метициллина. В то же время, метициллин, в сравнении с оксациллином, значительно менее стабилен при хранении, что и ограничивает его применение.

Ванкомицин-резистентный S.aureus

О возможности появления ванкомицинрезистентных S.aureus стали задумываться около десяти лет назад после сообщений о появлении резистентности к ванкомицину у энтерококков. Однако, прошло более десяти лет до появления первого сообщения в 1996 г. о выделении метициллинрезистентного S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину (МПК 8 мг/л) из клинического материала. Несмотря на значение МПК к ванкомицину, соответствующее диапазону умеренной резистентности, данный штамм был зарегистрирован как VRSA (ванкомицинрезистентный S.aureus), ввиду клинической неэффективности ванкомицина. У этого штамма не было найдено ни одного из ранее известных механизмов резистентности к ванкомицину; отмечено только увеличение толщины клеточной стенки и концентрации пенициллинсвязывающих белков 2 и 2а. Далее, одно за другим последовали сообщения о выделении из клинического материала штаммов S.aureus с МПК к ванкомицину 8 мг/л и получивших обозначение VISA (S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину).

В результате углубленного исследования ванкомицинрезистентности у MRSA, при скрининге более чем 2000 штаммов из различных стационаров, было выявлено от 1% до 25% (!) штаммов с гетерогенной (индуцибельной) резистентностью к ванкомицину, экспрессирующих её с частотой около 1 клетки на миллион. Такие штаммы могут являться предшественниками VRSA.

Специалисты до сих пор не пришли к согласию, какой термин использовать (VRSA или VISA), что связано с тем, что несмотря на значения МПК, соответствующее диапазону умеренной резистентности, налицо клиническая неэффективность ванкомицина при терапии VRSA и VISA инфекций. Другими словами, при отсутствии резистентности с фармакологической точки зрения, эти штаммы резистентны к ванкомицину с клинической и биологической точек зрения.

Многие специалисты предлагают свои методы для скрининга ванкомицинрезистентности у стафилококков, однако, до сих пор не разработано общепринятых стандартов. Таким образом, чрезвычайно важным является разработка методов лабораторной диагностики и мониторинга ванкомицинрезистентности, особенно у пациентов, получающих или получавших терапию ванкомицином/тейкопланином и при неэффективности этой терапии. Следует разработать методики для контроля за VRSA-инфекциями, предпринять меры по изоляции больных и носителей для предупреждения распространения VRSA. Кроме того, политика применения антибиотиков должна предусматривать снижение необоснованного назначения ванкомицина.

Источник

Определение чувствительности Staphylococcus spp.

При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 14.

Таблица 14.

Бета-лактамы

Препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и коагулазанегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять чувствительность стафилококков к этим препаратам.

Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллино-связывающего белка — ПСБ2а. Выявление и дифференцировка этих двух механизмов резистентности позволяет надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих препаратов. При этом необходимо учитывать следующие закономерности:

Штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП.
Бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины за исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности природных и полусинтетических амино-, карбокси- и уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины, цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов.
Штаммы Staphylococcus spp, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы исторически получили название метициллинорезистентных стафилококков (methicillin-resistant Staphylococcus spp -MRSS). Другими терминами для обозначения подобных штаммов являются MRSA — methicillin-resistant S.aureus и MRSE — methicillin-resistant S.epidermidis.
Метициллин в настоящее время в клинической практике и в лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью вытеснил оксациллин, соответственно появился термин «оксациллинорезистентность», являющийся полным синонимом термина «метициллинорезистентность».

Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp. к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов:

Определения чувствительности к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз (пенициллиназ).
Определения чувствительности к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена mecA.

Определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление продукции бета-лактамаз (пенициллиназ)

Определение чувствительности Staphylococcus spp. к бензилпенициллину несколько затруднено тем фактом, что синтез бета-лактамаз у этого микроорганизма является индуцибельным процессом (продукция фермента усиливается после контакта с антибиотиком). В результате этого при использовании стандартных методов серийных разведений и ДДМ возможно получение результатов ложной чувствительности.

Решением данной проблемы может быть использование метода непосредственного выявления бета-лактамаз, основанного на использовании дисков с нитроцефином. Нитроцефин представляет собой хромогенный цефалоспорин, который легко гидролизуется под действием всех бета-лактамаз с образованием окрашенного продукта.

Постановка теста

Для проведения исследования используют чашку, на которой оценивали чувствительноcть исследуемого штамма Staphylococcus spp. к пенициллину и/или оксациллину ДДМ. С границы зоны ингибиции роста вокруг диска с оксациллином бактериологической петлей забирается незначительное количество культуры и наносится на предварительно увлажненный диск с нитроцефином. Диск инкубируют при комнатной температуре до 1 ч.

Интерпретация результатов

Появление красного окрашивания свидетельствует о продукции бета-лактамаз исследуемым штаммом микроорганизма.

Штамм, продуцирующий бета-лактамазу, рассматривают как устойчивый к природным и полусинтетическим пенициллинам (за исключением оксациллина) независимо от конкретных результатов тестирования к перечисленным АБП.

Определение чувствительности к оксациллину

При определении чувствительности к оксациллину стандартными методами необходимо учитывать некоторые особенности:

для приготовления инокулюма используют только прямой метод суспендирования колоний;
длительность инкубации до момента учета результатов определения чувствительности к оксациллину должна составлять не менее 24 ч.

Особенности тестирования ДДМ

Необходимо использовать диски, содержащие 1 мкг оксациллина.
При учете результатов необходимо обращать внимание даже на единичные мелкие колонии стафилококков, обнаруженные в пределах зоны подавления роста.

Особенности тестировании методами серийных разведений

В питательную среду целесообразно добавлять NaCl (до конечной концентрации 2 %).

Интерпретация результатов тестирования стафилококков к оксациллину

Штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, должны рассматриваться как устойчивые ко ВСЕМ бета-лактамным АБП.
Результаты определения чувствительности стафилококков к оксациллину и к другим бета-лактамным АБП могут быть противоречивыми, при этом результаты определения чувствительности к оксациллину являются решающими.
Определять чувствительность стафилококков к бета-лактамным АБП, кроме бензилпенициллина и оксациллина, нецелесообразно.
Для метициллинорезистентных стафилококков характерно наличие ассоциированной резистентности к АБП других групп. Выявление у стафилококков множественной резистентности при чувствительности к оксациллину требует проведения повторных исследований.
Следует обратить внимание на различия в критериях метициллинорезистентности для S.aureus и коагулазанегативных стафилококков.
При получении сомнительных результатов необходимо использовать дополнительные методы (скрининг на агаре — метод приведен ниже, прямое выявление гена mecA или белка ПСБ2а).

Выдача клиницистам результатов исследования и рекомендаций по лечению

При выделении пенициллино- и метициллино-чувствительных штаммов стафилококков микроорганизм считается чувствительным ко всем бета-лактамным АБП, а препаратами выбора будут природные и аминопенициллины.
При выявлении продукции бета-лактамаз и чувствительности к оксациллину микроорганизм является резистентным к природным пенициллинам, амино-, карбокси- и уреидопенициллинам, но чувствителен к оксациллину, ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам I — II поколений, которые являются препаратами выбора в данном случае. В отношении данных штаммов будут также активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы, однако преимуществами в сравнении с препаратами выбора они не обладают.
При выявлении метициллинорезистентности штамм считается устойчивым ко ВСЕМ бета-лактамным антибиотикам, для лечения необходимо использовать препараты других групп, из которых препаратами выбора считаются гликопептиды.

Дополнительные методы выявления метициллинорезистентности

Наиболее надежным методом выявления метициллинорезистентнсти у стафилококков является непосредственное определение наличия гена mecA молекулярно-генетическими методами (с помощью полимеразной цепной реакции — ПЦР). Кроме того, разработан коммерческий метод выявления дополнительного пенициллиносвязывающего белка — ПСБ2а в реакции агглютинации.

В то же время скрининг на агаре для выявления метициллинорезистентности является высоко чувствительным и специфичным методом, легко выполнимым в условиях рутинной работы микробиологической лаборатории, однако он может быть использован только для штаммов S.aureus.

Постановка теста

Для проведения скрининга готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтон, содержащие 4 % NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина. Хлористый натрий вносят в питательную среду в необходимом количестве до автоклавирования. Рабочий раствор оксациллина добавляют в питательную среду после автоклавирования и охлаждения среды до 45 — 50 °С. Для приготовления рабочего раствора оксациллина используют субстанцию АБП с известной активностью.

Микробную взвесь следует готовить только методом прямого суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококка, выросших на чашке с неселективным питательным агаром, в стерильном физиологическом растворе и доводить до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5 x 10 8 КОЕ/мл).

Инокуляция

Для инокуляции чашек с агаром можно использовать два метода: с помощью микропипетки или с помощью стерильного ватного тампона.

Метод I (микропипеткой)

готовят разведение 1:100 стандартного инокулюма, соответствующего стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду, для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5 x 10 6 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора);
с помощью микропипетки наносят каплю (10 мкл) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином.

Метод II (с помощью тампона)

стерильный ватный тампон погружают в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем отжимают избыток влаги о стенку пробирки;
культуру наносят тампоном либо на ограниченную поверхность (диаметром 10 — 15 мм), либо на всю поверхность агара с оксациллином в чашке Петри.

Инкубация

Штаммы S.aureus инкубируются при температуре 35 °С в течение полных 24 ч, а коагулазанегативных стафилококков — в течение 48 ч.

Учет результатов

После инкубации чашки тщательно просматривают в проходящем свете:

появление видимого роста более 1 колонии или вуалеобразного роста на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину);
при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину).
при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.

Контроль качества

Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера-Хинтон с 4 % NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
Параллельно с исследуемыми тестируют также контрольные штаммы: S.aureus ATCC 38591 — резистентный; S.aureus ATCC 29213 — чувствительный.

Макролиды и линкозамиды

Макролиды и линкозамиды являются альтернативными препаратами для лечения стафилококковых инфекций. В исследование необходимо включать:

Одного из представителей 14-ти и 15-членных макролидов. Полная перекрестная резистентность между отдельными представителями.
Клиндамицин. Полная перекрестная резистентность между 16-членными макролидами и линкозамидами.

Приведенный выбор препаратов определяется закономерностями перекрестной резистентности между антибиотиками указанных подгрупп.

Фторированные хинолоны

В последнее время отмечается повышение интереса к фторхинолонам как к препаратам для лечения стафилококковых инфекций (особенно кожи и мягких тканей). Новые представители этой группы АБП (антипневмококковые фторхинолоны — левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.) обладают повышенной активностью в отношении Staphylococcus spp. в сравнении с традиционными препаратами. Между перечисленными подгруппами препаратов нет полной перекрестной резистентности. Антипневмококковые препараты часто сохраняют активность в отношении штаммов, устойчивых к другим фторхинолонам.

Аминогликозиды

На практике необходимо учитывать некоторые особенности интерпретации результатов, полученных in vitro. Так, при детекции устойчивости к гентамицину выделенный штамм следует рассматривать как устойчивый ко всем аминогликозидам. В этой связи гентамицин должен включаться в набор для тестирования в обязательном порядке. В тоже время крайне редко могут встречаться штаммы, устойчивые к другим аминогликозидам при чувствительности к гентамицину.

Ванкомицин

Ванкомицин является одним из препаратов выбора (наряду с оксазолидинонами) для лечения инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами. Появление сообщений об устойчивости стафилококков к гликопептидам требует внимательного отношения к оценке результатов исследования.

Дополнительные препараты

Линезолид

Оксазолидиноны являются важным достижением в лечении инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, в том числе и устойчивыми к гликопептидам. В то же время, необходимо иметь ввиду, что уже известно о формировании устойчивости к антибиотикам этой группы.

Другие препараты

Ко-тримоксазол.
Хлорамфеникол.
Фузидиевая кислота.
Тетрациклины.
Рифампицин.

Значение перечисленных препаратов в лечении стафилококковых инфекций, вызванных метициллинчувствительными штаммами, невелико, так как они уступают по активности бета-лактамам. Их клиническая эффективность при инфекциях, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, изучена недостаточно.

Рифампицин, ко-тримоксазол и фузидиевую кислоту нельзя рекомендовать как средство монотерапии из-за высокой частоты селекции резистентности в процессе лечения.

Формировать конкретный набор антибиотиков для оценки антибиотикочувствительности стафилококков наиболее целесообразно на основании данных о частоте распространения в стационаре метициллинрезистентности. При отсутствии или низкой частоте метициллинрезистентности вполне достаточно ограничиться оценкой чувствительности к оксациллину (в плане надзора), макролидам и, возможно, еще к 1 — 2 препаратам, реально применяемым в конкретном стационаре для лечения стафилококковых инфекций. В случае же высокой частоты распространения метициллинрезистентности в исследование необходимо включать достаточно широкий круг антибиотиков.

Источник